Trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, các bệnh liên quan đến tim mạch như: nhồi máu cơ tim, suy tim, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, đột quỵ… đang gia tăng một cách báo động. Một trong những nguyên nhân quan trọng của bệnh tim mạch là tắc nghẽn mạch máu, đó là tình trạng nghẽn mạch máu do các cục máu đông, có thể dẫn tới nhồi máu cơ tim cấp tính và đột quỵ do thiếu máu cục bộ. Cả hai nguyên nhân này đều dẫn tới tử vong. Theo Hiệp hội tim mạch Hoa Kỳ cho biết, hơn 80% bệnh nhân bị nhồi máu não là do cục máu đông làm tắc mạch [1].
Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ. Hoạt tính làm tan huyết khối của nattokinase tương đối mạnh và kéo dài, giảm chứng cao huyết áp, phân giải protein dạng amyloid, tăng cường hoạt hóa plasminogen và làm bất hoạt các chất ức chế plasminogen [2]. Do đó, nghiên cứu chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp nattokinase cao làm nguồn giống và ứng dụng sản xuất ra sản phẩm chứa enzyme nattokinase là cần thiết.
Theo kết quả nghiên cứu từ tháng 5/2021 tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng đã phân lập được 49 dòng vi khuẩn trên môi trường Lysogeny Broth Agar (LB agar). Cụ thể, 29 chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu đậu nành được lý lên men, ký hiệu Na1-Na29; 13 chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn mẫu bã đậu nành, ký hiệu Na30- Na42; 7 chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu natto thương phẩm, ký hiệu Na43-Na49. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu định danh sơ bộ các chủng dựa vào đặc điểm hình thái và sinh hóa. Khi quan sát đặc điểm hình thái đa số các khuẩn lạc phân lập được có dạng hình que, tròn, màu trắng sữa, một số màu trắng đục, mép răng cưa, bề mặt khuẩn lạc lồi, nhẵn bóng. Qua kết quả làm tiêu bản giọt ép và nhuộm đơn đã chọn được 31/49 (63,26%) chủng vi khuẩn có dạng hình que, còn lại 18/49 (36,74%) chủng vi khuẩn có dạng hình tròn và hình cầu. Bên cạnh đó, việc lựa chọn các chủng thuộc chi Bacillus trong phạm vi đề tài dựa trên ba yếu tố: dương tính catalase, có khả năng di động, thử nghiệm khả năng lên men mannitol dương tính, kết quả lựa chọn được 17/22 (77,27%) chủng vi khuẩn.
Để tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột, protein bằng phương pháp đo vòng phân giải, vi khuẩn được nuôi cấy vạch trên môi trường LB agar có bổ sung thêm cơ chất để tuyển chọn, ủ ở 37oC, trong 24 giờ và nhuộm với dung dịch thuốc thử Lugol đối với sở tuyển phân giải tinh bột và nhuộm với Frazie đối với sơ tuyển phân giải protein. Từ 17 chủng được lựa chọn để sơ tuyển, kết quả đo đường kính vòng tròn phân giải tinh bột của các dòng vi khuẩn dao động từ 2,56-13,50(mm), vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột cao nhất là chủng Na17 (13,50 mm) và thấp nhất là chủng Na22 (2,56mm), cả 2 chủng này phân lập từ nguồn mẫu đậu nành hạt xử lý lên men. Kết quả đo đường kính vòng tròn phân giải protein cho thấy các dòng vi khuẩn dao động từ 0,47-30,27(mm), vi khuẩn có khả năng phân giải protein cao nhất là chủng Na9 (30,05mm) được phân lập nguồn mẫu đậu nành hạt xử lý lên men và vi khuẩn được phân lập từ natto thương phẩm có khả năng phân giải protein thấp nhất là Na48 (0,47mm).
Tiếp theo, việc sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột, protein được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Theo đó, vi khuẩn được nuôi lỏng lắc trên môi trường Lysogeny Broth, sau 48 giờ, tiến hành lọc - thu enzyme thô. Các đĩa thạch chứa môi trường LB Agar được bổ sung riêng biệt với 1% tinh bột và 0.5% casein sử dụng để đánh giá khả năng phân giải tinh bột và protein một cách tương ứng. Dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn được nhỏ vào các lỗ trên bề mặt thạch đĩa thạch. Ủ ở 5-6oC trong 8 giờ để dịch enzyme khuếch tán vào bề mặt thạch, rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ để enzyme phân giải cơ chất. Nhuộm với dung dịch thuốc thử Lugol đối với sơ tuyển phân giải tinh bột và nhuộm với Frazie đối với sơ tuyển phân giải protein. Kết quả đo đường kính vòng phân giải tinh bột dao động từ 8,28-19,27 (mm), với chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein trung bình cao nhất là Na9 (19,27mm) được phân lập từ nguồn mẫu đậu nành hạt xử lý lên men và chủng có khả năng phân hủy tinh bột thấp nhất là Na45 (8,28mm) được phân lập từ nguồn mẫu natto thương phẩm.
Vậy, từ kết quả tuyển chọn với 2 phương pháp khác nhau, chúng tôi nhận thấy có 05 chủng vi khuẩn: Na7, Na9, Na17, Na29, Na45 là những chủng có hoạt tính mạnh nhất trong những chủng còn lại nên được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo.
Protase tổng số bao gồm nattokinase và các protease khác. Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính nattokinase sơ bộ bằng cách định tính enzyme nattokinase: đo vòng phân giải fibrin. Kết quả thể hiện như bảng 1.
Bảng 1: Đường kính vòng phân giải fibrin của các chủng vi khuẩn
| Chủng vi khuẩn | Đường kính (mm) |
| Na7 | 10,29a |
| Na9 | 32,95b |
| Na17 | 28,48c |
| Na29 | 3,26d |
| Na45 | 21,11e |
Ghi chú: Các kết quả đường kính vòng phân giải fibrin giống nhau được biểu thị cùng một chữ cái, các chữ cái khác nhau biểu thị sai khác ở mức ý nghĩa 95%, kiểm định Ducan
Từ bảng 1 cho thấy, chủng Na9 (32,95 mm) và Na17 (28,48 mm) có đường kính vòng phân giải fibrin là lớn nhất, các chủng Na7, Na45 lớn hơn chủng còn lại.
Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu sinh tổng hợp, ba chủng vi khuẩn Na9, Na17, Na45 được khẳng định lại bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger. Kết quả được thể hiện trong bảng 2:
Bảng 2: Kết quả định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử
| Ký hiệu chủng vi khuẩn | Nguồn mẫu | Mức độ tương đồng | Tên loài |
| Na9 | Đậu nành hạt xử lý lên men | 100 | Bacillus subtilis |
| Na17 | Đậu nành hạt xử lý lên men | 99,93 | Bacillus subtilis subsp. subtilis. |
| Na45 | Natto thương phẩm | 100 | Bacillus subtilis subsp. subtilis. |
Qua các thí nghiệm định lượng, lựa chọn được chủng Bacillus subtilis Na9 có hoạt tính nattokinase cao nhất được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu. Các yếu tố nhiệt độ và thời gian, tỷ lệ giống, dộ dày cơ chất, ảnh hưởng của oxy được lựa chọn để sàng lọc khả năng ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn thu nattokinase. Kết quả nhận được hoạt tính enzyme cao nhất với tỷ lệ giống 3% (3% trên 50 g cơ chất đậu nành hấp chín), độ dày 3 cm, trong điều kiện lên men hiếu khí ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Sau khi chọn các điều kiện tối ưu nhất thu được hoạt độ protease (702,50UI/g) và nattokinase (598,40FU/g).
Từ các điều kiện tối ưu đã khảo sát, chúng tôi xây dựng được quy trình sản xuất natto ở quy mô phòng thí nghiệm. Từ đó, tiến hành thực nghiệm sản xuất thử nghiệm sản phẩm natto tại phòng thí nghiệm Trung tâm với chủng đã tuyển chọn và nguồn giống đối chứng từ 03 nguồn đậu nành khác nhau với quy mô 01kg/mẻ (lặp lại 3 lần). Trước khi đưa vào sử dụng, sản phẩm natto được đánh giá cảm quan, phân tích chỉ tiêu hóa lý và vi sinh vật. Kết quả cho thấy cảm quan sản phẩm đạt loại Khá (20 phiếu), hàm lượng dinh dưỡng đảm bảo, không có vi sinh vật như E.coli hay Samonella..
Hình 1: Thành phẩm natto sản xuất được
Trong thời gian đến, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành nghiên cứu, khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm như: ảnh hưởng của thời gian đến cấu trúc của sản phẩm natto; ảnh hưởng của nhiệt độ hấp và thời gian bảo quản đến chất lượng của sản phẩm natto. Đồng thời, tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện khả năng ứng dụng của chủng Bacillus subtilis Na9 tạo chế phẩm nattokinase ngăn ngừa sự hình thành huyết khối.
Tài liệu tham khảo
[1] D. Mozaffarian, EJ. Benjamin , AS. Go, DK. Arnett, MJ. Blaha, et al, et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 2015 Jan 27. 131 (4):e29-322.
[2] K. Yamane and M. Hiroshi, “Hybrid α - amylase produced by transformants of Bacillus subtilis - Purification and characterization of extracellular α - amylase produced by the parental strains and trasformants”, Biochimica et Biophysica Acta, 365, 1974, pp. 235-247.
Oanh Hoàng
